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- 文件名称：四色流式细胞术用于急性白血病免疫分型的中国专家共识（2015年版）
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热烈祝贺：埃克森成为泰尔茂比司 [2016-03-16]
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四色流式细胞术用于急性白血病免疫分型的中国专家共识（2015年版）
白血病免疫分型是利用不同单克隆抗体检测白血病细胞胞膜和胞质抗原，通过流式细胞术（FCM）分析其表型，实现对白血病细胞系列来源及其分化程度的诊断。白血病免疫分型已成为诊断白血病的必要依据，同时也可为微小残留病（MRD）的检测以及白血病的治疗和预后提供重要信息。白血病免疫分型是细胞形态学分型的重要补充和进一步深化，以荧光标记技术联合FCM检测并判定白血病免疫表型，具有准确、快速、客观、重复性好、特异性强等特点，提高了白血病诊断的准确性。
采用不同数量及组合的荧光标记免疫抗体处理白血病细胞并进行荧光检测及分型是免疫分型的关键环节。准确诊断需要选择一定数量的抗体，白血病免疫分型涉及多个造血系列的抗原，但目前国内甚至国际上均无规范化的方案可以借鉴；国内不同的医疗单位所用的抗体数量和种类均有较大的异质性，有些单位由于应用的抗体数量较少或抗体选择不当，影响对疾病的诊断、分期和预后的判断。
鉴于国内的实际情况，中国免疫学会血液免疫分会临床流式细胞术学组经过多次讨论，提出以CD45/侧向散射光（SSC）为基础的中国FCM急性白血病免疫分型四色方案，本方案以2组表面抗原作为筛查抗原，试图利用相对少的抗体，达到对各个类型白血病进行较全面的检测，具有快速、客观、准确的特点。已在国内的多家医疗单位试用，证明此方案能够满足临床的需要。目前，虽然国际上有八色甚至十色方案，但对仪器及操作人员的技术要求较高。鉴于国内的实际情况，我们首先提出中国FCM急性白血病免疫分型四色方案，供从事急性白血病免疫分型的实验室参考，以期促进我国急性白血病免疫分型诊断的规范化及整体水平的提高。
理想的急性白血病免疫分型方案应满足以下几点要求：①识别白血病细胞，能将其与正常细胞或反应性细胞相区别；②鉴别白血病细胞的系列来源；③根据细胞的分化程度对疾病进行亚型分型；④鉴别用于检测MRD的白血病相关免疫表型（LAIP）；⑤帮助判断某些特异分子改变，即基因型检测；⑥提供预后相关及治疗靶点的免疫标志检测结果。
为了保证免疫分型的准确度，满足不同的临床需要，本共识将抗体应用分为诊断必选抗体和可选择抗体：必选抗体包括诊断必选及MRD检测必选抗体，后者主要是用于筛查治疗后MRD检测的 LAIP，如果在治疗前未进行检测，治疗后可能难以弥补，因此均作为必需检测的抗体;可选择抗体包括白血病亚型诊断、基因型检查及治疗靶点等检测所需的抗体。各单位可根据具体情况进行选择性应用。
常用免疫荧光染料有FITC（异硫氰酸荧光素）、 PE（藻红蛋白）、CY5 （花青素）、preCP（叶绿素蛋白）、ECD（藻红蛋白-得克萨斯红）、APC（别藻蓝素）等，本共识推荐的荧光染料为perCP、FITC、PE及 APC。
（一）适应范围
1. 急性淋巴细胞内血病（ALL）：
(1) B系：早期前体 B-ALL(Pro-B-ALL)、普通型 B-ALL(Common-B-ALL)、前体 B-ALL (Pre-B-ALL)及与Burkitt淋巴瘤进行鉴别。
(2) T 系:早期前体T-ALL(Pro-T-ALL)、前体T- ALL(Pre-T-ALL)、皮质 T-ALL 和髓质 T-ALL。
2. 急性髓系白血病（AML）：
(1) AML微分化型(AML-M)；
(2) 急性早幼粒细胞白血病(APL)；
(3) AML伴粒系和单核细胞分化型(AML-Mi/2 和 AML-M4/5)
(4) 急性红白血病(AML-M6);
(5) 急性巨核细胞白血病(AML-M7)。
3. 其他类型的急性白血病：
(1) 前体树突细胞肿瘤；
(2) 急性嗜碱粒细胞和肥大细胞白血病；
(3) 混合表型急性白血病(MPAL)。
4. 筛查MRD检测的标志。
（二）抗体选择
1. 必选抗体：包括诊断及MRD检测必选抗体。表1、2为诊断B-ALL、T-ALL和AML必选的抗体。在诊断T-ALL和AML时必须进行这些抗体的检测。在B-ALL中有60%左右患者CD19st+CD10+CD34+，按照2008版WHO分类标准，可以诊断 B- ALL，不必检测 cCD79a、CD22、nTdT。而有 30%〜40% B-ALL患者CD34阴性，此时nTdT阳性对诊断B-ALL尤为重要。如果nTdT阴性（极少患者），应该进一步检测膜免疫球蛋白（Ig）或膜K、轻链，如果膜Ig或k、X轻链均阴性，多提示为B-ALL。由此可见，B-ALL的必选抗体可以根据具体情况有所变化。
表1、2还包括MRD检测必选的抗体。目前的研究结果证实治疗后MRD水平是判断白血病患者预后的独立因素。MRD的检测已成为白血病分层及个体化治疗及判断预后的重要指标。在治疗前应该对检测MRD的标志进行筛查，以便治疗后利用多参数FCM进行MRD监测。
MRD的检测需要掌握正常细胞不同系列、不同分化阶段细胞的抗原表达顺序和表达强度。因此，首先要了解所使用的抗体组合中，每个抗原的正常分化规律和表达强度，当这些抗原的表达顺序及表达强度发生变化时，即为LAIP。另外白血病细胞可以表达交叉系列抗原，也是LAIP的一种表型，因此可以适当增加其他系列抗原的检测，尤其是对AML患者，以便于分析判断。
对于B-ALL患者，建议监测CD45、CD10、CD19、CD34、CD38、CD123、CD58 抗原表达的强度变化。B-ALL经常表达髓系抗原如CD13、CD33，可以用于MRD检测，为了减少抗体的应用，在此不作为必选抗体，各单位可选择性应用。对于T-ALL 患者，可以选择CD34、nTdT、cCD3并结合其他的T 细胞标志，如CD7、CD3、CD5等，以检测骨髓或外周血中的幼稚T细胞或异常幼稚T细胞，当幼稚T细胞比例高于正常范围，尤其是出现异常幼稚T细胞时，提示存在MRD。对于AML患者，首先观察髓系标志抗原强度是否异常，及是否出现早期和晚期标志共表达，还应检测是否表达淋系标志，如CD7、CD56、CD19等。其他标志如CD5、CD2表达比例相对低，可选择性应用。
表1、2中的抗体为目前诊断主要的急性白血病必选，但随着临床研究的深入，其抗体的数量可能会随之增加。如2009年国际上提出早期T前体白血病(early Tprecursor, ETP)是 T-ALL的一种形式，临床预后非常差。基因表达谱和免疫表型特征说明ETP是T细胞在分化过程中阻滞于非常早期的阶段，与造血干细胞及髓系祖细胞相关。文献报道此类白血病的免疫表型特点为不表达CD1a、CD8，弱表达CD5，至少表达一种或更多的干细胞及髓系标志，如 CD 117、CD34、HLA-DR、CD 13、CD33、CD 11 b 及CD65。因对ETP的诊断标准和临床意义还在研究中，在此作为参考。
2. 可选择的抗体：
(1) 亚型检测可选择的抗体：急性白血病的亚型分类在一定程度上反映了白血病的分化程度。根据正常细胞的分化规律，WHO提出了对于 B-ALL和T-ALL亚型的分类标准（表3、4）。目前国际上对亚型诊断的必要性仍有不同的观点，有学者认为其与预后无明显相关性，且其分型抗原的科学性有待研究。另外，一些关键性标志，如cCD79a、 CD22、CD1a的表达强度可能因使用的抗体不同，而产生不同结果，影响对白血病系列来源的鉴别。但是，对于T-ALL亚型的分型，有文献报道皮质 T-ALL预后相对较好。另外，一些临床医师希望对亚型进行分型。因此，亚型的诊断在此不列为必要的检测。各个医院可根据不同的临床需求进行选择性检测和应用。
(2) 急性白血病基因型检测所需抗体：对于AML和ALL患者，特殊基因型的诊断是非常必要的。WHO的分类中已将具有特殊预后和临床意义的基因异常的白血病患者进行单独分类。当然这些基因异常白血病的诊断需要分子生物学和细胞遗传学的方法进行确定。个别具有特殊基因型的内血病细胞具有较突出的免疫表型表现，往往提示存在相关的遗传学异常，但不能作为确诊的依据。主要特殊基因型急性白血病的免疫表型见表5。这些标志抗原不作为必选的检测标志，可选择性应用。
(3) 预后和治疗靶点的检测：CD20、CD33、CD52、CD45、CD123等标志可能与预后或临床针对某些标志的特异性单克隆抗体药物相关，如需对预后进行评估或指导靶向药物的选择，可适当选择。对于前文中未提及的抗原，均不作为必选标志。
（一）资料收集
临床资料的完整有助于顺利完成临床实验室相关检查。这些资料包括患者年龄、性别、外周血细胞计数、疾病分期（初诊、复诊、MRD等）、前期治疗详情及疾病复发等信息，此外，还包括细胞形态学分析和细胞化学分析等检查结果。这些信息均对四色方案具有辅助作用。
（二）临床标本的收集、运送、保存
采用肝素或EDTA抗凝，以骨髓为主，如果骨髓干抽，则抽取外周血。应根据外周血白细胞计数决定标本采集量，一般为4〜5 ml。如外周血WBC >10x109/L可适当减少，< 4x109/L应适当增加采集量。
采集后尽快送往实验室，标本接收时应按要求对标本进行状态检查，若发现标本凝血时应尽量进行检测，如果检测后因标本问题不能作出诊断时，应在报告中注明，并记录存档。标本放置于室温或4 ℃，应在1~3 d 内完成FCM检测。
（三）仪器和试剂
1. 仪器：采用可进行FITC、PE、APC 及PerCP/PE-CY5四色荧光检测的流式细胞仪即可。
2. 试剂：主要是抗体的应用，因生产抗体的公司较多，有不同的克隆，可能造成检测结果差异较大，各单位在选择时，可以根据文献报道，选择质量好且稳定的抗体和克隆，在此不作规定。但有少数抗体，如TdT 等，不同的公司检测结果差异较大，需要慎重选择。另外在判断LAIP 时，要比较抗原表达的差异，即抗体的荧光强度是否存在异常。在比较荧光强度时，特别要注意必须用同一公司、同一克隆、同一荧光素标记的单抗。因此，要尽量保持抗体使用的一致性。如果需要更换抗体，需要做好充分的比对。
（四）两步法进行免疫分型+MRD抗原筛选的参考抗体组合
临床应用中，多数患者在免疫分型检测前，不知属于何种系列急性白血病。虽然细胞形态学检测联合细胞化学检测能初步判断AML或ALL，但对于ALL 患者仍然无法判断是B、T 或NK 系列。对于AML患者，为了除外MPAL及MRD的检测，一些淋系标志如CD7、CD56、CD19 仍然需要常规筛查。因此，往往需要筛查较多的抗体。为了利用相对较少的抗体，达到对各个亚型白血病进行较全面的检测，可以采用两步法，即首先利用较少的抗体，对患者进行筛查，确定患者是否为白血病及属于哪个系列；然后根据初步判定的系列，进行第二步检测，以对该系列白血病进行全面的检测及筛查MRD检测的标志。对于第一步筛查所使用的抗体，国际上多选用胞内的cCD3、cCD79a 和cMPO，但是鉴于胞内抗原检测需要透膜处理，标记步骤较多及费时，影响因素也较多，并可能影响结果的准确性，在此提出以膜抗原为基础的两步法的抗体组合（表6）。膜抗原CD7和CD19虽然不是T系和B系特异性标志，但其敏感性较强。而对于部分髓系白血病，cMPO可能出现阴性，可选用髓系较敏感的膜抗原标志如CD33、CD117 帮助分型。这些方案已在临床经过上万次的验证，证明是可行的。具体抗体组合见表6，供参考。
（五）两步法四色方案
第一步：筛查抗体组合第1和第2管（表6）；第二步：根据第一步检测结果，进行第二步标记。
1. B-ALL：经第一步检测，在CD45/SSC图中可见明显幼稚细胞，SSC较小，与淋巴细胞相似，CD45 可以阳性，也经常为阴性。CD117和CD7为阴性（90%以上），而CD33可以阳性或阴性，如为阴性，其他表型：①CD19st+CD10st+CD34+，如图1所示，可以诊断B-ALL。需要进一步选B-ALL第4管，以筛选 MRD检测标志。B-ALL第3管虽然为必选抗体，但此种表型，B-ALL诊断已经明确，可以不必检测。 B-ALL第5〜6管作为亚型、基因型及MRD检测的可选抗体，可选择性应用。②CD19st+CD10+/-CD34-，提示B-ALL，需要检测B-ALL第3〜5管。如果CD22+ cCD79a+ nTdT +，可以诊断 B- ALL ；如果 CD22+cCD79a+nTdT-，但cμ-κ-λ-，诊断B-ALL ；如果cμ+，即使κ-λ-；，也要与周围型B细胞淋巴瘤进行鉴别。③CD19dim+CD117+CD33+或同时CD7+，需除外 MPAL，需要检测B-ALL第3和第8管，根据2008版WHO 血液及淋巴系统肿瘤分类的诊断标准（表7）对不同类型的MPAL或AML、B-ALL和T-ALL进一步完善诊断。
2. T-ALL：经第一步检测，在CD45/SSC图中可见明显幼稚细胞，表型为：①CD7+/st+CD34+CD10+/-CD117+/-CD19-CD33-，如图 2 所示，则提示 T-ALL。需要进一步标记T-ALL第3〜5管。如果1）cCD3 + nTdT+ ；2）cCD3+nTdT-CD3-；3）cCD3+nTdT-CD3-CD4/CD8+；4）cCD3+nTdT-CD3-CD1a+或 CD99+诊断 T-ALL。②出现cCD3+nTdT-CD3+时需要与周围型 T细胞增殖性肿瘤进行鉴别，必要时进行FCM- TCRvp或TCR基因重排及结合形态学和病理检测综合诊断。
3. AML：经第一步检测，在CD45/SSC图中可见明显幼稚细胞，表型为CD33 + CD117 +CD34 +/-CD19-/dim + CD10-/+CD7-时，如图 3 所示（1 例典型 AML-M2第1〜2管抗原表达结果），则考虑为AML，建议进一步标记AML第3〜6管。另外：①如果CD45-细胞比例较多，为确定是否为有核红细胞，则标记CD71、GIyA，以帮助诊断AML-M6。②如临床怀疑AML- M7，或不似典型AML，则检测CD41、CD61 (CD42)。③如果出现 CD56 + CD4 +CD64- CD14-CD123st+HLA-DR+时，提示为树突细胞，则检测CD303、CD304。④嗜碱粒细胞白血病非常少见，要结合形态检测。正常嗜碱粒细胞表型为CD123st+ HLA-DR- CD117dim +，原始细胞可以表达CD34、CD33、CD13、CD203G和CD11b，因此可对这些抗原进行检测。⑤肥大细胞白血病非常少见，表达 CD117、CD25、CD9、类胰蛋白酶，部分细胞表达 CD22和nTdT，可对这些抗原进行检测。
4. 混合表型：如果既表达髓系标志，又表达 CD7或CD19，则可首先检测MPAL的第3管，确定是哪个系列的白血病，然后再完善检测该系列的其他标志。
在AML中有30%左右患者表达CD7，但通常表达较弱，多同时表达CD33和CD117。而T-ALL中 CD7多数表达较强，并多不表达CD33，20%左右表达 CD117。另外 AML 伴 t (8;21)(q22;q22)/AML- ETO阳性患者中，60%左右表达CD19（弱），同时表达 CD34、CD117、CD33（弱）、CD56，与典型 B-ALL 可以鉴别。如果出现图3表型，怀疑AML伴CD7+，可以选择B-ALL第8管，同时检测AML第3〜6管。如果出现CD19dim+CD10-和髓系标志阳性，应该进一步检测髓系特异性标志cMPO和B系特异性标志 cCD79a和cCD22，以判断是否为混合表型白血病。
（六）一步法进行免疫分型+MRD抗原筛选的参考抗体组合
对于初治的临床怀疑急性白血病的患者，如果采用一步法进行检测，可根据表1〜2中的必选抗体进行选择，同时需要进行亚型及基因型检测时，可根据具体情况进行选择。
如果患者的细胞系列来源清楚时，或为 B-ALL、T-ALL和AML复治患者时，可参考两步法方案，选择相应的抗体组合进行一步法免疫分型检测。
本共识主要针对免疫分型检测中关键的环节，即抗体的选择及应用进行了讨论及推荐。其他的一些环节也是非常重要的，例如，仪器、试剂和实验过程的质量控制、样本的制备、数据的分析和解释及报告的规范化。关于这些内容，国际临床和实验室标准化协会出版了《血液淋巴系统肿瘤细胞的临床流式分析指南》，在此指南中已经详细地阐述了这些问题，在此不作赘述。建议中国的流式实验室参考此指南执行，以保证我们的检测质量及水平。
综上所述，本共识将急性白血病免疫分型的抗体选择分为必选和可选两类。并提出了两步法进行免疫分型的参考抗体组合。其宗旨是通过使用较少的抗体，达到对不同类型的急性白血病进行较全面的免疫表型分型，为临床提供必要的信息。希望本共识能够为临床进行免疫分型的单位提供参考标准。
中华血液学杂志.2015,36(4):265-271(转自医脉通)
